آزمایش MPN (شناسایی باکتری های کلیفرم و کلیفرم مدفوعی به روش تخمیر چند لوله ای)
روش تخمیر چند لوله ای برای باکتری های گروه کلی فرم
گـروه کلی فرم شامل جنس های متعددی از باکتری های متعلق به خانواده آنتروباکتریاسه ها هستند. شناسایی این گروه از باکتری ها از طریق تخمیر لاکتوز می بـاشـد. بـر اسـاس روش تخمیر، ایـن گـروه تحت عنوان باکتری های هـوازی و بی هـوازی اختیاری، گـرم منفی، بـدون اسپور و میله ای شـکـل کـه در دمـای ۳۵ درجه سانتیگراد، لاکتوز را ظـرف ۴۸ سـاعـت تخمیر و تولید گـاز و اسید می کنند، تعریف می شـونـد. یکی از روش هـای استاندارد بـرای شناسایی گـروه کلی فـرم بـر اسـاس روش تخمیر چند لوله ای (مرحله احتمالی، تأیید و تکمیلی) می باشد. نتایج آزمایش به صـورت محتمل ترین تعداد ممکن (MPN) ارگانیسم های مـوجـود بیان می شـود. این عدد بر اساس فرمول های احتمالات، تخمینی از تـراکم متوسط کلی فـرم هـا در نمونه مـورد بـررسـی ارائـه می نماید. رضـایـت بخش ترین احتمالات زمانی بدست خواهد آمد که بیشترین غلظت های ساخته شده از نمونه، در تعدادی یا همه لوله ها تشکیل گاز را نشان بدهد و کمترین غلظت هـای نمونه، تشکیل گـاز در هـمـه یـا اکثریت لـولـه هـا را نشان ندهـد. تراکم باکتریایی به کمک جدول MPN که بر اساس توزیع پواسون تهیه شده است و نیز فرمول توماس بدست می آید.
لوله های حاوی محیط کشت
طرز تهیه محیط کشت ها
نحوه ذخیره سازی
محیط کشت های خشک (بدون آب) را در بطری هایی که درب آنها محکم بسته شده و در جـای تـاریـک و دمـای کمتر از ۳۰ درجه سانتیگراد و رطوبت پایین نگهداری می کنیم. در صورتی که محیط های کشت تغییر رنگ دهند و یا به حالت کیک و قالب درآیند و یا اینکه خصوصیت پودری خود را از دست دهند، نباید از آنها استفاده کرد. بسته های محیط کشت خشک را در مقادیر کم طوری تهیه می کنیم که بعد از باز کردن در طی ۶ ماه مصرف گردد. همچنین انواعی از محیط کشت خشک کـه حـاوی عـامـل های انتخابی مثل سدیم آزید، مشتقات نمک بـایـل و آنتی بیوتیک ها و آمینواسیدهای حاوی سولفور هستند بـه کـار می بریم. بـرای بدست آوردن حداکثر انتخاب پذیری محیط کشت، از مقادیر نسبتاً تازه (در طی یک سال از خرید) استفاده می نماییم.
محیط کشت را در مقادیری تهیه می کنیم که در طـی کمتر از یـک هفته مصرف شـوند. اگـر محیط کشت هـا در لوله های در پیچدار ریخته شده است، بـه مـدت بیشتر از ۳ مـاه قـابـل نگهداری می باشند. محیط کشت را دور از نور مستقیم خورشید باید نگهداری کنیم و از آلودگی و تبخیر بیش از اندازه آنها می بایست جلوگیری کرد.
اگر محیط کشت های موجود در لوله های تخمیر در یخچال و حتی حرارت های معمولی پایین نگهداری می شوند، ممکن است هـوای کـافـی در آنها حـل شده و در طی انکوباسیون در ۳۵ درجه سانتیگراد حباب هوا در لوله ایجاد می شود. لوله های تخمیر را که در دمای پایین نگهداری شـده انـد، قبل از استفاده به مدت یک شب انکوبه می کنیم و لوله های حاوی هوا را دور می ریزیم. لوله های تخمیر ممکن است در دمـای تقریباً ۲۵ درجه سانتیگراد نگهداری شوند، اما به دلیل تبخیر سریع محیط در این شرایط که منجر به تغییرات قابل ملاحظه ای در غلظت ترکیبات سازنده می شود و در این دما به مـدت بیش از یـک هفته نباید نگهداری کـرد. لـولـه هـایـی را کـه بیش از ۱ میلی لیتر تبخیر شـده انـد را دور می ریزیم.
بعد از حـل کردن محیط کشت، فـوراً آن را در لـولـه هـای کشت تـوزیـع می کنیم و در مـدت ۲ سـاعـت استریل می نماییم. محیط کشت های غیر استریل را نبایستی نگهداری کرد. تمام محیط های کشت به جز براث های قند و یا براث هایی با سایر خصوصیات در اتوکلاو با دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه بعد از آنکه به دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد رسید استریل می کنیم. هنگامی که فشار بـه صفر رسید، محیط کشت را از اتوکلاو خـارج کرده و سریعاً سرد می کنیم تا از تجزیه شدن قندها در نتیجه تماس طولانی مدت با گرما جلوگیری شود. برای اینکه گـرم کردن به طور یکنواخت انجام گیرد و سرد کردن سریعاً انجام شود، مواد را شل و در مقادیر کـم بسته بندی می کنیم. براث هـای قند را در دمـای ۱۲۱ درجه سانتیگراد بـه مـدت ۱۲ الی ۱۵ دقیقه استریل می کنیم. مـاکزیمم زمـانـی کـه قند در معرض حـرارت قـرار می گیرد بایستی ۴۵ دقیقه باشد.
تهیه محیط کشت
آب
برای تهیه محیط کشت و مـعـرف ها فقط از آب مقطر یا آب غیر معدنی استفاده می کنیم که بایستی قبلاً آزمایش شود و مشخص گردد که فاقد هر گونه فلزات محلول و تـرکیبات بازدارنده یا باکتری کـش اسـت. سمیت آب ممکن است از آب فلورینه شده با سیلیس بالا ناشی شود. منابع دیگـر سمیت آب، نقره، سرب و انـواع کمپلکس های آلـی نـاشـنـاخـتـه دیگر می باشد. اگـر در قسمت جمع کننده آب، مـاده استـریـل بـه کـار رفته بـاشد، در دستگاه آب مقطر گیری، آمین های سمی در آب مقطر وجود خواهند داشت. کلر یا کلرآمین های باقیمانده هـم ممکن است در آب مقطری که از منابع آب کلر زده تهیه شده یافت شود. اگر ترکیبات کلردار در آب مقطر وجـود داشته باشد، آنها را با افزودن مقدار لازم تیوسولفات سدیم یا سولفیت سدیم خنثی نمود. آب مقطر بـایـد عـاری از مواد غذایی آلوده کننده باشد. آب مقطر باید دور از نور مستقیم خورشید نگهداری شـده تـا از رشد جلبک هـا جلوگیری به عمل آید. آب مقطر کهنه در صورتی که به مدت طولانی در ظروف روباز نگهداری شـود، ممکن است حاوی ترکیبات آلی فرار سمی جذب شده از اتمسفر باشد. عملیات نگهداری مناسب معمولاً باعث حذف آلودگی به مواد مغذی می گردد.
لوریل سولفات براث
لوریل سولفات براث یک غلظتی : ۳۵٫۶ گـرم از پـودر آمـاده لوریل سولفات براث را در یک لیتر آب مـقـطـر حـل می کنیم و در حجم های ۱۰ میلی لیتر در لـولـه هـای کشت توزیع می نماییم و یک لوله درهـام داخل هرکدام از لـولـه های کشت می انـدازیـم و درب آنها را می بندیم. سپس در اتـوکلاو بـه مـدت ۱۵ دقیقه در دمـای ۱۲۱ درجه سانتیگراد استریل می کنیم.
لوریل سولفات براث دو غلظتی : ۷۱٫۲ گـرم از پـودر آمـاده لـوریـل سـولفات بـراث را در یـک لیتر آب مقطر حل کرده و در حجم های ۱۰ میلی لیتری در لـولـه های کشت توزیع می کنیم و یـک لـولـه درهـام در داخل هر کدام می اندازیم و درب آنها را می بندیم. سپس در اتوکلاو به مدت ۱۵ دقیقه در دمای۱۲۱ درجه سانتیگراد استریل می نماییم.
لوریل سولفات براث سه غلظتی : ۱۰۶٫۸ گـرم از پـودر آمـاده لوریل سولفات براث را در یـک لیتـر آب مقطر حـل کـرده و در حـجـم هـای ۱۰ میلی لیتری در لـولـه هـای کشت تـوزیـع می کنیـم و یـک لـولـه درهـام در داخـل هـر کـدام می اندازیم و درب آنها را می بنـدیـم. سپـس در اتوکلاو به مدت ۱۵ دقیقه در دمـای ۱۲۱ درجه سانتیگراد استریـل می نماییم.
در آزمـایـش MPN معمولاً بـه جـای محیط کـشـت لاکتوز بـراث، از محیط کشت لـوریـل سولفات براث استفاده می شود؛ زیـرا در مرحله احتمالی محیط کشت لاکتوز بـراث، احتمال نتیجه مثبت کـاذب بسیار زیـاد است ولی در محیط کشت لوریل سولفات براث این احتمال وجود ندارد.
دستگاه اتوکلاو
دستگاه شیکر (جهت گرم کردن و هم زدن محلول ها همراه با مگنت)
BGB براث ( برلیانت گرین بایل لاکتوز براث )
۴۰ گرم از پودر آماده BGB براث را در یک لیتر آب مقطر حل کرده و در حجم های ۱۰ میلی لیتری در لوله های کشت توزیع می کنیم و یـک لوله درهام در داخل هر کدام می اندازیم و درب آنها را می بندیم. سپس در اتوکلاو به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد استریل می نماییم.
EC براث
۳۷ گرم از پودر آماده EC براث را در یک لیتر آب مقطر حل کرده و در حجم های ۱۰ میلی لیتری در لـولـه هـای کشت توزیع می کنیم و یـک لوله درهام در داخل هر کدام می اندازیم و درب آنها را می بندیم. سپس در اتوکلاو به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد استریل می نماییم.
محیط های کشت بعد از استریل شدن به مدت یک هفته در یخچال در دمای ۱۰ – ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم.
تهیه آب رقیق سازی
از آب مقطر سترون شـده حـاوی بـافـر رقیق سـازی نمونه هـا استفاده می شود. ایـن آب از محلول ذخیره (غلیظ) بافر فسفات تهیه می گردد.
محلول ذخیره فسفات : ۳۴ گرم فسفات دی هیدروژن (KH۲PO۴) را در ۵۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل می کنیم. PH ایـن محلول باید برابر با ۷٫۲۰ باشد که توسط PH سنج اندازه گیری می شود. در صورت نیاز می توان PH را با افزودن چند قطره محلول هیدروکسید سدیم ۱ نرمال (۴گرم در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر) افزایش داد. حجم بافر ساخته شده را بـا آب مقطر بـه یـک لیتر می رسـانیم. در مـواقعی کـه از محلول ذخیره استفاده نکنیم، درب آن را محکم بسته و ظرف را در دمای ۱۰ – ۴ درجه سانتیگراد نگه می داریم.
محلول ذخیره کلـرید منیزیم : ۸۱٫۱ گرم کلرید منیزیم ۶ آبه را در یـک لیتر آب مقطر حل می کنیم، سپس درب آن را بسته و در دمای ۱۰ – ۴ درجه سانتیگراد نگهداری می نماییم.
تهیه سوسپانسیون باکتری و آب رقیق سازی را بـه مدت بیش از ۳۰ دقیقه در دمای اتاق نباید انجام داد زیرا ممکن است منجر به مرگ و یا تکثیر باکتری ها شود.
رقیق سازی نمونه
در مورد نمونه هایی کـه حجم نمونه کمتر از ۰٫۱ میلی لیتر است، از رقت های کسری می بایست استفاده کرد. بـه هنگـام آزمایش فـاضلاب و آب هـای دارای کـدورت، حجم ۰٫۱ میلی لیتر را از نمونه اصلـی کشت نمی دهیم، بلکه رقیق سازی مناسب تهیه می نماییم.
مرحله احتمالی برای آب های کلرینه و خام
در مرحله تشخیص و احتمالی، روش تخمیر چـنـد لوله ای، از لوریل سولفات بـراث بـه عنوان محیط کشت استفاده می شود. در صورتی که محیط کشت بعد از سترون شدن در یخچال نگهداری شده بـاشند، قبل از استفاده بـاید بـه مدت یک شب در انکوباتور ۳۰ درجه سانتیگراد قرار گیرد. پس از این مدت، لـولـه هایی کـه در آنها رشـد میکروبـی و یـا حباب گـازی مشاهده شد، کنار گذاشته می شوند.
روش انجام آزمایش
ردیف های ۵ تایی از لوله های آزمایش را در محفظه نگهدارنده لـولـه قـرار می دهیم. تعداد ایـن ردیـف ها و حجم نمونه انتخابی بستگی به کیفیت و ویژگی های نمونه مورد آزمایش دارم. بـرای آب آشامیدنی ۵ لوله با حجم بیش از ۳۰ میلی لیتر آماده می کنیم. در هر لوله آزمایش ۱۰ میلی لیتر محیط کشت لوریل سولفات براث ۳ غلظتی وجـود دارد. بعد از ۲۵ بار تکان دادن بطری نمونه در هـر لـولـه آزمـایـش ۲۰ میلی لیتـر نمونه را بـا پیپت وارد می کنیم. برای آب های غیر آشامیدنی برای هـر رقت (ml 10، ۱، ۰٫۱ نـمـونـه) ۵ لـولـه آمـاده می نماییم. در ۵ لـولـه اول ۱۰ میلی لیتر محیط کشت لوریل سولفات براث دو غلظتی و در ۱۰ لوله بعدی، ۱۰ میلی لیتر محیط کشت لـوریـل سولفات براث یک غلظتی وجود دارد. ظرف حاوی نمونه ها و محلول هـای رقـیـق شـده را ۲۵ بـار بـه شـدت تکان می دهیم. در هـر گروه ۵ تایی از لوله ها، حجم مشخصی از نمونه را بـه ترتیب بـا افزایش رقـت یـا کاهش ضـریب رقیق سـازی اضافه می کنیم (در ۵ سـری اول ۱۰ میلی لیتـر نـمـونـه، در ۵ سـری دوم ۱ میلـی لیتـر نـمـونـه و در سـری سـوم ۰٫۱ میلی لیتر نمونه). مخلوط داخل لـولـه ها را با تکان دادن آرام لوله، مخلوط می نماییم. لوله ها یـا بطری هـای حـاوی نمونه و محیط کشت را در دمـای ۳۵ درجه سانتیگراد در انکوباتور قـرار می دهیم. بعد از ۲۴ ساعت، هر لوله یـا بطری را به آرامی و با حرکت چرخشی تکان داده و آن را از نـظـر میـزان رشد میکـروبـی، وجـود یـا عـدم وجـود گـاز و واکنش هـای اسیدی (سایه های زرد رنگ) بررسی می کنیم. چنانچه در ایـن مرحله تشکیل گـاز یـا اسید مشاهده نگردید، آنها را مجدداً به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور قرار می دهیم. پـس از ۴۸ سـاعـت لـولـه ها را بـررسی می کنیم، وجـود یـا عدم وجود رشد زیاد گاز و اسید را یادداشت می نماییم. تولید گـاز در لـولـه هـا طـی ۴۸ سـاعـت بیانگر پاسخ مثبت بـه آزمـایـش احتمالـی است. لـولـه های مثبت را بـرای آزمایش در مرحله تأییدی نگه می داریم. عـدم تشکیل گـاز در پـایـان ۴۸ ساعت بیانگـر نتیجه منفی می بـاشـد. اگـر لـولـه هـای مـرحـلـه احتمالی در آب های خام در دو یـا تعداد بیشتری از رقـت هـای متوالی طـی مـدت ۲۴ سـاعـت مثبت بـاشـد، در مـرحـلـه تـأییدی فـقـط لـولـه هـای رقـیـق تـرین گـروه کـه هـمـگی مثبت بـوده بـه عـلاوه لـولـه هـای مثبت گـروه هـای رقیق تـر بـرای آزمـایـش انتخاب می شـونـد. مقدار MPN مرحله احتمالی را از روی تعداد لوله هـای مثبت این مرحله محاسبه می نماییم.
مرحله تأییدی
تمام لوله ها یا بطری های آزمایش مرحله احتمالی را که پس از ۲۴ یا ۴۸ ساعت گـرمـاگـزاری تشکیل گـاز در آنها مشاهده شده است، برای مرحله تأییدی آزمایش می شوند. چنانچه رشـد گـاز در لوله احتمالی زودتـر از ۲۴ ساعت ظاهر شد، می تـوان آنها را پیش از اتمام زمان ۲۴ ساعته به مرحله تأییدی منتقل نمود. لوله های مرحله احتمالی را که تولید گاز در آنها مشاهـده می شود بـه آرامـی می چرخانیم یـا تکان می دهیم تـا میکرو ارگانیسم ها در آنها به صورت شناور در آیند. با یک لوپ فلزی استریل به قطر ۳٫۵ – ۳ میلی متر یک لوپ (قطره) کامل از کشت میکروبی داخـل لـولـه احتمالی مثبت را بـه لـولـه حـاوی مـحیـط کـشـت BGB (بـرای Total Coliform) و EC (بـرای کلیفرم های مدفوعی) منتقل می کنیم. سپس آن را خـارج کـرده و در اتوکلاو استریل کرده و دور می انـدازیم. این کار برای لوله های احتمالی مثبت تکرار می شود. محیط کشت BGB تلقیح شده را بـه مدت ۴۸ ساعت در دمـای ۳۵ درجـه گرماگـزاری می کنیم. تشکیل گـاز بـه هـر میزان در لـولـه هـای دورهـام در هـر زمـان از ۴۸ سـاعـت گرماگزاری، بیانگر پاسخ مثبت در ایـن مرحله است. مقدار MPN را از تعداد لوله های مثبت این مرحله از آزمایش را محاسبه می نماییم. همچنین بـرای محیط کشت EC بـه مـدت ۲۴ سـاعـت در دمـای ۴۴٫۵ درجه سانتیگراد گـرمـاگـزاری می نماییم.
مرحله تکمیلی
این مرحله را برای لوله هایی که در مرحله تأییدی نتیجه مثبت داشته اند انجام می دهیم تا مشخص گردد کـه آیـا کلیفرم در نمونه وجود دارد یا نه.
اگـر نتیجه آزمایش لوله های حـاوی محیط کشت EC براث مثبت باشد، نشانه مثبت بودن مرحله تکمیلی و وجود کلیفرم های مدفوعی می باشد. در حالی کـه اگر نتیجه BGB مثبت ولی جواب EC براث منفی باشد، نشانه وجود کلیفرم های غیر مدفوعی است.
محاسبه و بیان MPN
برای محاسبه غلظت یـا تـراکم باکتری هـا از روش بیان آمـاری محتمل تـریـن تعداد یـا بیشترین تعداد احتمالی (MPN) استفاده می شـود. روش محاسبه بـوسیله جـداول MPN (در دستورالعمل هـای آزمایشگاه ثبت شده) و فرمول زیر می باشد :
اگر در یک سری لوله با رقت های دهدهی بیش از ۳ نوع رقت وجودداشته باشد، تنها از نتایج ۳ گروه برای محاسبه MPN استفاده می شود. برای انتخاب این ۳ گروه، بالاترین میزان رقتی (رقیق ترین نمونه) که هر ۵ لوله آن پاسخ مثبتی داشته انـد به همـراه دو گروه بعدی از لوله ها که به ترتیب رقیق ترین هستند، برای محاسبه MPN در نظر گرفته می شود.
شستشو و استریل کردن
تمام ظروف شیشه ای را به خوبی با دترجنت مناسب و آب گرم شسته و با آب گـرم طـوری آبکشی می نماییم کـه تمام ترکیبات ماده شوینده حذف شـونـد. سپس بـا آب مقطر آب کشی می کنیم. سترون کـردن ظروف شیشه ای نباید کمتر از ۶۰ دقیقه در دمـای خشک ۱۷۰ درجه سانتیگراد بـاشـد. ظروف شیشه ای که داخل محفظه فلزی قرار دارند، باید حداقل ۲ ساعت در دمای ۱۷۰ درجه سانتیگراد سترون شوند. ظـروف نمونه برداری، یـا به روش فوق و یا به مدت ۱۵ دقیقه در اتوکلاو با دمـای ۱۲۱ درجه سانتیگراد سترون شـونـد. بـرای پیشگیری از تغییر شکل، درب ظـروف پلاستیکی نباید محکم شده بـاشـد. زمـان استریل کردن در اتوکلاو ۱۲۱ درجه سانتیگراد بـرای محیط کشت های تازه ۱۵ – ۱۲ دقیقه، برای مـواد آلـوده و محیط کشت های دور ریختنی ۳۰ دقیقه و برای آب رقیق سازی ۱۵ دقیقه می باشد.